同位素示蹤法

2008/12/3 7:25:00

  同位素示蹤(zōng)法(fǎ)（isotopic tracer method）是(shì)
利(lì)用放射(shè)性(xìng)核(hé)素作為示蹤劑對研究對象進(jìn)行標記的微量分析方法
，示(shì)蹤實驗的創(chuàng)建(jiàn)者是Hevesy。Hevesy於(yú)1923年(nián)首先用天然放射性212Pb研究鉛鹽在豆科植物內的(dí)分布和(hé)轉移📆。繼後Jolit和Curie於(yú)1934年發現(xiàn)了人工放射性，以及其後生產方法的建(jiàn)立（加速器，反應堆(duī)等），為放(fàng)射性同位素(sù)示蹤法(fǎ)的更快的發(fā)
展和廣泛應用提供(gōng)了基本的條件和有力的(dí)
保障
。
一，同(tóng)位(wèi)素示(shì)蹤法基本原理和特點
　　同位素(sù)示蹤所利用(yòng)的放射性核素（或穩定性核素）及它們的化合物📵，與自然界存在的相應普通元素及其(qí)化合物之間的化學性質和生物學性質是相同(tóng)的，隻是具有不同的核物理性質。因此，就(jiù)
可以用同位素作為一種標記(jì)
，製成含有同位素的(dí)標記化合物（如標(biāo)記食物，藥物和代謝物質(zhì)等）代替(tì)
相應的非標(biāo)記化合(hé)
物。利用放射性同位(wèi)素不斷地放出特征射綫的核物理性質，就可以用核探測器隨時追蹤它在體內或體外的位置，數量及其轉變等，穩(wěn)定性同位素雖然不釋放射綫(xiàn)
，但可以利用它與普通相應(yīng)
同位素的質量之差，通過(guò)質譜儀
，氣相層析儀
，核(hé)磁共振等質量分析儀器來測(cè)
定(dìng)。放射(shè)性同(tóng)
位素和(hé)穩定性(xìng)同(tóng)
位(wèi)素都(dū)可作為示蹤(zōng)
劑（tracer），但是
，穩定性同位素作為示蹤(zōng)劑(jì)其(qí)靈敏度較低(dī)，可獲得的種類少
，價格較(jiào)
昂(áng)貴，其應用範圍受到限製

；而用放(fàng)射性同位素作為(wéi)示蹤劑(jì)不僅靈敏(mǐn)度，測量(liáng)方法簡便易行，能(néng)準確地(dì)定(dìng)量，準(zhǔn)確地定位及符合所研究對象的(dí)生理條件等(děng)特點：
1.靈敏度高
　　放射(shè)性(xìng)
示蹤法可測到10-14－10-18克水平，即可以(yǐ)從1015個非(fēi)放射性原子中檢出一個放射性原(yuán)子。它比目前(qián)較敏感的重量分析天(tiān)
平要敏感108-107倍
，而迄今最(zuì)準確的化學分(fēn)析(xī)法很(hěn)難測定(dìng)到10-12克水平。
2.方法簡便(biàn)
　　放射性(xìng)測定不受其它非放射性(xìng)物質的幹(gān)擾，可以省略許多復雜的物質分離步驟
，體內示蹤時🐷，可以利用(yòng)
某些放射性同位素(sù)釋放出穿(chuān)透力強的r射綫🤷，在體(tǐ)外測量而獲得結果，這就大大簡化了實(shí)驗過程，做到非(fēi)
破壞性分析(xī)
，隨著液體閃爍計(jì)數(shù)的發展🥏，14C和3H等發射(shè)軟β射綫(xiàn)
的放射性同位素在醫學(xué)及生物學實驗中(zhōng)得到越來越廣(guǎng)泛的應用。
3.定位(wèi)定量準(zhǔn)確
　　放射性同(tóng)
位素示蹤(zōng)法(fǎ)能準確定量地測定代謝(xiè)物質的轉移和轉變,與某些形態學技術相結合（如(rú)病(bìng)

理組織切片技術，電子顯微鏡技(jì)術(shù)等）🃔，可(kě)以確定放(fàng)射(shè)性示蹤劑在組織器官中的定量分布，並且對組織(zhī)器(qì)官的定位準確度(dù)可達細(xì)胞水平，亞細胞水平乃至分子水平。
4.符合生(shēng)理條(tiáo)件
　　在放射性(xìng)同位素實驗(yàn)中，所引(yǐn)
用的放射性標記化合(hé)物的化學量是極微量的，它對體內原有的(dí)相應(yīng)物質的(dí)重量改變(biàn)是微(wēi)不足道的
，體(tǐ)內生理(lǐ)過程仍保(bǎo)持正(zhèng)常的平衡狀態，獲得的(dí)
分析結果符合(hé)生理條(tiáo)
件，更能反映客觀存(cún)在的(dí)事物本質。 放射(shè)性同位(wèi)素示蹤(zōng)法的優(yōu)點如上所述(shù)
，但也存在一些(xiē)缺陷，如從事放射性(xìng)同(tóng)位素工作的人(rén)員要(yào)受一定(dìng)的(dí)
專門訓練
，要具(jù)備(bèi)相應的安全防護措施和(hé)條件(jiàn)，在目前(qián)個別元素（如氧，氮(dàn)等）還沒有(yǒu)合適的放射性(xìng)同位素等等。在作示蹤實(shí)驗時，還必須注意到示蹤(zōng)
劑的同位素效應(yīng)和放射效(xiào)應問題(tí)。所謂同位素效應(yīng)
是指放射性同(tóng)位素(sù)（或是(shì)穩定(dìng)性同(tóng)位素）與相應的普通元素之間存在(zài)著化學性質上的微(wēi)小差異所引起的個別(bié)
性質上的明顯區別🏚，對於輕元(yuán)素而言，同位素(sù)效應比較嚴重🕠。因(yīn)為同位素之間的質量判別是倍增的(dí)，如3H質量是1H的三倍，2H是1H的兩倍，當用氚水（3H2O）作示蹤劑時，它在普通H2O中(zhōng)的含量不(bù)能過大，否則會使水的物理常數，對細胞膜的滲透及細胞質粘性等都會發生改變。但在一般(bān)的示(shì)蹤(zōng)實驗中，由同位素效(xiào)應引起的誤差，常在(zài)實驗誤差(chà)內，可忽略不計🦘。放射(shè)性(xìng)同位素釋(shì)
放的(dí)
射綫利於追蹤(zōng)測量，但射綫對生物體的(dí)作(zuò)
用達到一定劑量(liáng)時，會(huì)改(gǎi)變(biàn)機體的生理狀態🕸，這就是放(fàng)射性(xìng)同位素的輻射效(xiào)應，因此放射性同位素的用量(liáng)應小於安(ān)全劑量(liáng)，嚴格控製在生物機(jī)體所能允許的(dí)範(fàn)
圍之內🖪
，以免(miǎn)實驗對(duì)
象受輻射損傷，而得錯誤(wù)的結果
🥷。
二(èr)
，示(shì)蹤實驗的設計原則
　　設計一個放射性同位素的(dí)示蹤實驗應(yīng)從實驗的目的性，實(shí)驗所(suǒ)具備的條件和對(duì)放射性的防護(hù)水平三方麵(miàn)著手考(kǎo)慮。原則上必須從兩個主要方麵來設計放射性示(shì)蹤實(shí)驗：一是必(bì)須尋(xún)求(qiú)有效的，可重復的測定放射性強度的條(tiáo)件，二是必須(xū)選擇一個合適的(dí)比活度λqδ（單位是(shì)原子／時間／分子，dpm／mol或ci／mol）。其中🥟，λ＝-dＮ’dt／Ｎ’為(wéi)該(gāi)處放射性原(yuán)子核的衰變常數。q＝Ｎ ’／n’
，表示n’個該化學形式分子為Ｎ’個放射性原子所(suǒ)標記。δ＝n’／n表示放射性標記的分子(zǐ)數n’與總分(fēn)子數(shù)（標(biāo)記的(dí)加未標記的(dí)）n之比。采用放射性同位(wèi)素示蹤技術來實現所研究課(kè)

題預(yù)期目(mù)的全部或一部(bù)分，一般須(xū)經過(guò)
實驗準(zhǔn)備階段，實驗階段和放射性(xìng)廢物處(chǔ)理三(sān)個步驟🃊。
（一(yī)）實(shí)驗(yàn)
準備階段
1.示蹤劑的選(xuǎn)擇
　　選定放射(shè)
性示蹤劑的比活度λqδ的值必須(xū)足夠(gòu)大🕕，以保證實驗所需要的靈敏度，而又要盡可能地小🖎

，使得在該實(shí)驗條件下輻射自分解(jiě)可忽略
。一般情形是根據實驗(yàn)目(mù)的和(hé)實驗周(zhōu)期長短，來選擇具有合(hé)適(shì)的衰變方式，輻射類型和半衰期，且放射毒(dú)性低的放射性同位素。至今已確定的放射性(xìng)核素包括(kuò)
天然(rán)的58種和人工製造的約1300種，其(qí)中大多數不常(cháng)能(néng)用作放射性示(shì)蹤劑。主要原因是製(zhì)
備困難
🃇，半衰期不合適及放射性不足以定(dìng)
量(liáng)
。在任何一種生產方法(fǎ)中，生產步驟(zhòu)很可能包含(hán)或多或少的化學處理，因而示蹤實(shí)驗人員需(xū)要了解某個核素及(jí)
其(qí)周(zhōu)圍(wéi)的(dí)
那(nà)些元素的化學性質(zhì)

，因為它們有(yǒu)可能成為此放射性同位(wèi)素的(dí)雜(zá)質。
　　放射性同位素都衰變（經過(guò)
或不經過中(zhōng)
間狀態）到處於(yú)
基態的子體核(hé)素，衰變時伴隨各種形(xíng)式的能量輻射(shè)，如α，β-🖆
，β+，γ🕌，X放射等。在選擇示蹤(zōng)劑時(shí)
，示蹤實驗人(rén)
員(yuán)要仔細(xì)研究衰(shuāi)變綱圖(tú)，根據實(shí)驗(yàn)條件和計數條件來決定那一(yī)種輻射(shè)🤁
，在衰變綱變內(nèi)
，代表核能(néng)級的兩條水平綫之間和距離表示能量差(chà)，↑或↓表(biǎo)示(shì)能(néng)級(jí)同(tóng)伴隨原子序數增或減(jiǎn)
少(shǎo)的能量，↓表示從(cóng)激發(fā)態至基(jī)
態的(dí)同質異能(néng)躍遷
。一般要選擇最適宜(yí)的半衰期τ的放射性同位素，使τ足夠長(cháng)，從而(ér)使衰變(biàn)校正有意義或幹脆不必作(zuò)衰變校正，同時又要足(zú)夠短，能(néng)較安全(quán)地進行示蹤(zōng)實驗，並使得放射性廢(fèi)物容易處(chǔ)理，在實際(jì)工作中，使用的放射性同位(wèi)素的半(bàn)衰(shuāi)
期應該與(yǔ)實驗需要持(chí)續的時間t相(xiāng)適應，如對於某個實驗
，t／τ＝0.04時，應所選放射(shè)性同位(wèi)

素的(dí)衰變校正為3.5％；而(ér)t／τ＝0.10時，應(yīng)
選(xuǎn)放射性同位素(sù)的衰變校正為6.6％。t／τ＝0.15時，應選用其衰變校正為10％。
　　在體外示蹤條件，一般選用半衰期較長(cháng)而射綫強度(dù)適中，既利於探測，又易於防護和保存(cún)
的(dí)放射性示蹤劑。體內示(shì)蹤條件下，若實驗周期短，應選(xuǎn)用半衰期(qī)短，且能放出一(yī)定(dìng)強度r射(shè)綫物放射(shè)性同位素，若實驗周期長🥾，如需要(yào)將(jiāng)動物活殺後對組織髒器分別測定的🧴，則應選(xuǎn)
用(yòng)
半衰期較長放(fàng)射性同位素。此外，根據實驗目的(dí)來選用定位的(dí)或不定位(wèi)的(dí)標記示蹤劑，例如研究氨(ān)基(jī)酸(suān)的脫(tuō)羧反應，14Ｃ應標(biāo)
記在(zài)
羧基上(shàng)📍，隻有這種定位標記的氨基酸(suān)，才能在脫羧後產生(shēng)14CO2💞。而(ér)有些實驗不要求特定位置標(biāo)記，隻須(xū)均匀標(biāo)記即可。
　　選擇放射性示蹤劑還必須同時滿足高(gāo)化學(xué)純度，高放射性核純度的要求(qiú)。在示蹤(zōng)劑(jì)製備期間🖛，貯存(cún)期間以用試驗體係中所使用的溶(róng)劑，化學試劑🍸

，酶等可能會產生化學雜質，放射化學雜質及輻(fú)射自分解(jiě)引起的放(fàng)射性雜質🗞，這些雜質的存在，使得示蹤實驗(yàn)
中使(shǐ)用的示蹤劑不“純”，而或(huò)多或少影(yǐng)響實驗的結果，甚至會導致錯誤結論。 氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）和尿嘧(mì)啶核(hé)苷(gān)（3H－UR）是(shì)兩種常用(yòng)的示(shì)蹤劑(jì)
，前者有效地(dì)結合到DNA中
，後者則摻入到RNA中，它們(mén)的(dí)輻射分(fēn)解速(sù)度(dù)
隨比較放射性的增高及保存時間的延長(cháng)而增加，在不(bù)
同(tóng)溫度和不同溶液中的穩定(dìng)性也不同。經保存八年(nián)
的3H-TdR約有35％輻射分解為3H－胸腺嘧啶，並導致二醇和(hé)水合物的形式🥳，在實驗中這雜質會(huì)很快(kuài)摻入細(xì)胞並與大(dà)分(fēn)子（很(hěn)可能是蛋白質）結合，而(ér)不是與DNA和RNA相結合，這些雜質用DNA酶和RNA酶處理細(xì)胞都(dū)不(bù)除去。3H－TdR和3H－UR貯存(cún)在-20℃的冷凍溶液中輻射分離速度要比(bǐ)
+2℃增加3－4倍，但低溫度（-140℃）對貯存也有利，在允許對(duì)
示蹤實驗(yàn)人員在選擇保存放射性示(shì)蹤劑時會有所啟(qǐ)發🚉。
2.放射性同位素測(cè)量方法的選擇
　　測量方法的(dí)選擇取決於射綫種類，對於α射(shè)綫通常可用硫化鋅晶體🕪，電(diàn)離室(shì)，核乳膠(jiāo)等方法(fǎ)探測(cè)；對(duì)能量高的(dí)β射綫可用雲母窗計(jì)數管🀁，塑料閃爍晶體及核乳膠測定，對於能(néng)量低的β射(shè)綫可用液(yè)體閃爍計數器測量：對於γ射綫則(zé)
用G-M計數管
，碘化鈉（鉈）閃爍晶體(tǐ)探(tàn)測。目前大多數(shù)實(shí)驗室主要采用晶體閃爍計數法(fǎ)和液體閃(shǎn)爍計數法兩種(zhǒng)測量(liáng)方式。
　　同一台探測儀(yí)器對不(bù)同(tóng)量的示(shì)蹤劑具有不同的最(zuì)佳工(gōng)作條件，在實驗準備階段要檢查探測器是否已(yǐ)調(tiáo)有所用(yòng)示蹤(zōng)同位素的工(gōng)作條件🂬，否則需(xū)要用一定量的示蹤劑作為放射源（或選用該同位素的標準源）

，把探測器的(dí)最佳工作條件調整好(hǎo)，並且要保證探測(cè)
器性(xìng)能處於(yú)穩定可靠的狀態🐏。
　　探測最佳工作條件的選擇方法🂶：一(yī)種(zhǒng)是測“坪曲綫”🛚，另一(yī)種是找最好的品質因素。對於光(guāng)電倍增管
，在理論(lùn)上(shàng)不存在(zài)
“坪”（plateau）。但隨著高壓(yā)的(dí)增加，在一定範圍內，脈衝數變化較小，形成(chéng)一段坡度較(jiào)小的電(diàn)壓脈衝(chōng)曲綫，通常(cháng)也稱其為坪。測坪曲綫(xiàn)的方法
：固定放射源，根據其射綫能量的大小
，初選 一個廣大(dà)器增益(yì)（放(fàng)大倍數(shù)
）和(hé)甄別器閾值。不斷地(dì)
改變高壓(yā)（由低到高
，均(jūn)匀增加伏度），每(měi)改變一次高壓(yā)
，都(dū)測定一(yī)次(cì)本(běn)
底和放射(shè)源的計數率，最後作出高壓本底計(jì)
數率和高壓(yā)放射(shè)源計(jì)數曲綫🀪。用同樣的(dí)方法，作另一(yī)個甄別閾值（放大倍數不變）下的高壓計數率曲綫，這樣反復多作幾條曲綫。必要時，還可固定甄別閾值，改變放大(dà)倍數，求出高壓(yā)計數率曲綫。應選擇“坪”比較(jiào)平(píng)坦的曲(qū)綫(xiàn)工作條件：甄(zhēn)別閾值和放大增益
，作為(wéi)正式(shì)
測定時間的(dí)儀器工作條件
🥘，高壓值應選擇在該“坪”中點(diǎn)
偏向(xiàng)起始段(duàn)一邊相應的高壓(yā)
值(zhí)🦾。品質因(yīn)素，又(yòu)稱為優值，是指在一定條件(jiàn)
下，要達(dá)到合適的統計數目所需要的時間是儀器的計數(shù)效率E和(hé)本底(dǐ)計數Nb的函(hán)
數🧯： 品(pǐn)
質因素F=E2／Nb它是衡量一(yī)台計(jì)數器性能(néng)的指標，儀器的品質因素F應該越大越好，品質因素(sù)F越大，表(biǎo)示測(cè)量效率E越高而本(běn)底Nb越(yuè)小💪。如果某(mǒu)放射性示蹤的標準源存在來源困難(nán)等問(wèn)題的話，可以用相對(duì)
品質因素f來(lái)代替📣。 相品質因素f=ns／nb 式中ns指某種放射性樣品的計數率。找最好品質因素的方(fāng)法與測坪(píng)曲綫一樣，作出幾條高壓－F（或f）的關係(xì)曲綫，在幾條曲(qū)綫中選(xuǎn)擇(zé)峰(fēng)值最高的曲綫(xiàn)。這根曲綫的峰值所對應(yīng)的條件：高壓
，甄別閾(yù)，放大倍數(shù)等，就是該儀器對被測同位素(sù)的最佳工(gōng)
作條件
。最佳品質(zhì)因(yīn)素不一定恰好(hǎo)落在“坪”上，有的在“坪”附(fù)近，有的卻在“坪”的(dí)下端。著(zhuó)眼於把同位素的整個(gè)能譜峰都計(jì)
下來的(dí)
示蹤實(shí)驗(yàn)者主張取“坪”所對應的工作條件，而(ér)著眼於優值者
，主張取(qǔ)最佳品質(zhì)
因素所對(duì)應的工作(zuò)條件，也(yě)有人折衷。如果(guǒ)某儀(yí)器本(běn)底很低，光電倍(bèi)增管(guǎn)
噪音很低和能譜分辯(biàn)高，二(èr)者應該相(xiāng)差不大🚆。同(tóng)一台儀(yí)器(qì)
的最佳工作條件，隨儀器的使(shǐ)用期延長而有所(suǒ)改(gǎi)變，不同的放射性同位素，其最佳工(gōng)作條(tiáo)件不同
🦋。因此核探測儀器的最佳工作條件具有專屬性(xìng)📊，並且要經常通過選擇其不同時期的最佳工作條件🔓。更不能不問被測同位素的(dí)種類
，而(ér)
千篇(piān)一律地使用同一個工作條(tiáo)件(jiàn)🔊。
　　為(wéi)了達到準確(què)地計數，可以長時間一次(cì)計數，或短時間多次(cì)測量，兩者(zhě)達到的標(biāo)準誤(wù)基(jī)本相同💏，為避免外界因素的影響，在實際工作中，取短時(shí)間多次測量較為合理適用。在測(cè)量樣品的放射性(xìng)時🕂，本底(dǐ)是一(yī)個重要影響因(yīn)
素。本底高，則(zé)
標準誤和標(biāo)準誤差都增大，尤其在樣品計數較低時，本(běn)底對標(biāo)準(zhǔn)誤(wù)
和(hé)標準誤差的(dí)影響就愈大，從(cóng)而影(yǐng)響實驗結(jié)果(guǒ)
的精度(dù)
，而且(qiě)為了(liǎo)達到一定的精度
🦄，勢別要增加樣品的測(cè)量(liáng)時間
。根據核衰變的(dí)統計規律，在實驗中如果樣(yàng)品數量少，選擇tN=1.4tb的比(bǐ)例（式中(zhōng)tN為樣品放射(shè)性測量(liáng)
時間，tb為本底測量時間）較為合理(lǐ)；如果樣品數量較多是一大批樣品，則延長本底測量時間tb
，取(qǔ)
tb的時間均值(zhí)，而tN則可相對短，這樣可(kě)節省時間，有利於縮短實驗周期
。對於示蹤實驗設計來說，樣品中(zhōng)所含放射(shè)性強度的(dí)
要求(qiú)🃂，是使(shǐ)其放射性計(jì)數率大於或等於本底計數的10－20倍🖽。
3.進行非放射性(xìng)
的模擬實驗，把實驗全過程預演(yǎn)一遍
　　同位素示蹤實驗要求準確
，仔細，稍有疏忽(hū)或考慮不周(zhōu)就匆忙進行正式實驗🚚
，既容易導致實驗失敗🂾，又會(huì)造成示蹤劑(jì)和其它實驗用品的浪費，還會增(zēng)加放射性廢物，增加實驗室本底水平
，使實(shí)驗者接受不必(bì)要的輻(fú)射劑量🦟，所以模(mó)
擬實(shí)驗不僅可以檢查正式(shì)實驗中所用器材(cái)，藥品(pǐn)是否合格(gé)，又可(kě)
以操作人員進行訓練(liàn)，以(yǐ)保證正(zhèng)式(shì)
實驗能順利進行。
（二）正式實驗階段
1.選擇放射性同位素的劑(jì)
量
　　同位素必(bì)須能經得起稀(xī)釋
，使其最後樣品的放(fàng)射性不能低於(yú)
本底，一般來說放射性同(tóng)位素(sù)在生物(wù)體(tǐ)內不是完全均匀(yún)
地被稀(xī)釋，可能在某些器官
，組織(zhī)，細胞，某些分子中有選擇性(xìng)地蓄積
，蓄積的部分(fēn)放射性就會很強，在這種(zhǒng)情況下，應以相關(guān)部(bù)位對示(shì)蹤(zōng)劑的蓄(xù)積率(shuài)來考慮示蹤劑用(yòng)量🖁。在細(xì)胞培養，切(qiē)片保溫，酶反應等示蹤實驗中，應依據實驗目的，反應時間(jiān)
及(jí)反(fǎn)
應體(tǐ)積的不同(tóng)來考慮示蹤劑的用量，通常小於(yú)一個(gè)微居裏或(huò)幾(jī)
個微居裏。 由於(yú)放射性同位素存在輻射效應，應該根據使用的放(fàng)射性核素的(dí)種(zhǒng)類🀠，將用量(liáng)
控製在(zài)最大允許劑量之內（maximun permissible dose）🂣，以免因劑量過大所造成的(dí)輻射效應(yīng)
，給實驗帶來(lái)較大的誤(wù)差🍬。
2.選擇示蹤劑給(gěi)入途徑
　　整體示(shì)蹤實(shí)驗時，應(yīng)根據實驗目的，選擇易(yì)
吸(xī)收🗓，易操作的給(gěi)入途徑(jìng)，一般(bān)給予的數量體(tǐ)積小
，要求給(gěi)予的劑量準確，防(fáng)止可(kě)能的損失和不必(bì)要的汙染(rǎn)。體外示蹤實驗時(shí)，應根據實驗設(shè)計的實驗步驟的某個環節(jié)加入一定(dìng)劑量的示蹤到反應係統中去，力求(qiú)
操作準確，仔細(xì)
。
3.放射性生物樣品的製備
　　根據實驗目的和(hé)示(shì)蹤劑的標記放射性同位素的性質製備放射性(xìng)生物樣品，其(qí)中(zhōng)放射性同位素(sù)的性質是生物(wù)樣(yàng)品製備形式的主要依據。若是釋放r射綫(xiàn)的示蹤(zōng)劑
，則(zé)樣品製備比較容易，隻要定(dìng)量地取出被測物放入井型NaI（TL）晶(jīng)體內就能測(cè)定；若(ruò)是釋放出硬β射綫的示蹤劑，須將生物(wù)樣品製成厚度(dù)較薄的液(yè)體，或將液體鋪(pū)樣後烘幹，也可灰化後鋪(pū)樣

，放入塑料晶體閃爍儀內測定(dìng)，或用鐘罩型蓋一革計數管探測；若(ruò)標記同位素僅(jǐn)釋放軟β射(shè)
綫，那麼(mó)樣品應製成液(yè)體閃爍樣品（詳見放(fàng)射性測量”一章），在液體閃爍計數器內測(cè)
量。不論采(cǎi)用(yòng)何種測量方法，都應該對樣品作定量采集(jí)
。對某些放射性分散的樣品，應當作適當濃集(jí)
，如測定組織內蛋白質的放(fàng)射性，應對蛋白質作提取處理然(rán)後製備成相應的測(cè)量樣品。有些樣品需(xū)采用灰(huī)化法，但(dàn)灰化法對易揮發的同位(wèi)
素或(huò)
易揮(huī)發的組織樣品(pǐn)不合適。
4.放射性樣品的(dí)測量
　　測量方(fāng)法分為絕對(duì)測量和相(xiāng)
對測(cè)量(liáng)
。絕(jué)對測量是對樣品的(dí)實(shí)
有放射(shè)性(xìng)強(qiáng)度(dù)作測量，求出樣品中標記(jì)同位(wèi)素的實際衰變率，在作絕對測量時
，要糾正一些因素對測(cè)量結(jié)果的影響
，這些因素包括儀器探頭(tóu)對於放射源的(dí)相(xiāng)對立體角，射綫被探頭(tóu)接收後被計數的幾率，反散射， 放(fàng)射源的自吸收(shōu)
影(yǐng)
響等等。而(ér)
相對測量隻是(shì)在某個(gè)固定的探測儀(yí)器上作放射性強(qiáng)度的相對(duì)測量，不(bù)
追求它(tā)
的實際衰(shuāi)變率(shuài)
。在(zài)一般的示蹤實驗(yàn)中，大多采(cǎi)
用相對測(cè)量的方法，比較樣品(pǐn)間(jiān)的差(chà)異。在相對測量時🤍，要注意保持樣品與探測器之(zhī)間的幾何位(wèi)置固定。幾何條件的影響是放(fàng)射性測量中最重要的影響因素。當兩個放射性強度相同的(dí)樣品在測量中所置(zhì)的(dí)幾何位置不一(yī)，或樣品製(zhì)備過程(chéng)造成的幾何條(tiáo)件差異，其計(jì)數會相差很多，尤其(qí)
當樣品與探頭之間(jiān)距(jù)離較(jiào)近時
，兩者計數率相差會很大。但是當樣品與探頭之間相距較遠時，由於樣品與探頭之間形成的(dí)相對立體角較(jiào)小，所以兩者計數率的差異會顯著減小
。在用(yòng)紙片法測量3H標記(jì)物的(dí)放射性強度時，要注(zhù)意紙片在閃爍瓶中的位(wèi)
置，一批樣品應該一致
，如果是(shì)
將(jiāng)濾紙(zhǐ)剪成圓狀作支持(chí)物，圓片的直(zhí)徑最好與閃爍瓶(píng)底的直徑相等，保證濾(lǜ)
紙在閃爍(shuò)瓶內的位置固定。減小幾何(hé)條件(jiàn)對(duì)放射性測量(liáng)的影響可以從三方(fāng)麵入手(shǒu)
：⑴選擇探測窗大的探測(cè)器，如(rú)光電倍(bèi)增(zēng)管作探(tàn)
頭的探測器；⑵在(zài)樣品製備時(shí)
，注意盡(jìn)量將樣(yàng)品做成點狀源，這樣(yàng)
當樣品的放射性(xìng)強(qiáng)度較弱時🦦，由於距離探測窗較近而有可(kě)能造成的水平位(wèi)
移的影響就可以忽略🔶；⑶無論樣(yàng)
品距離探測窗遠近
，樣品都應置於探測窗的垂直軸綫(xiàn)上

🐠，以減少樣品(pǐn)與探測窗之間(jiān)的相對(duì)立體角(jiǎo)
。
（三(sān)）放射性去汙染和放射性廢物(wù)處理
　　放射性實驗，無論是每次實驗或階段性實驗結(jié)束後，都可(kě)能有不同程度的放(fàng)
射性汙染(rǎn)和(hé)放射性(xìng)廢物(wù)的出(chū)現，因此，在(zài)實驗(yàn)結束(shù)後，要(yào)
作去汙染處理和放射性廢(fèi)物處理。必要時在實驗過程進行中，就(jiù)要作除汙(wū)染和清(qīng)理放射性廢物的工(gōng)
作。
三，同位素示蹤法在生物化學和分子生物學中的應用
　　放射(shè)性同(tóng)位(wèi)素示(shì)蹤法在(zài)生物化學和(hé)分子生物學領域應用極為廣泛，它為揭示體內和細胞內理化過(guò)程的秘密，闡明生命活動的(dí)物質(zhì)基礎起了極其重要(yào)的作用。近幾(jī)年來，同位素示蹤技術(shù)在原(yuán)
基礎上又有許多新發展🃮，如雙標(biāo)記和多標記技術，穩定性同位素示蹤技術🂣，活化分析
，電子顯(xiǎn)微(wēi)鏡技術，同位素(sù)技(jì)
術(shù)與其它新技術相(xiāng)結合等(děng)。由於這(zhè)些(xiē)技術的發(fā)展(zhǎn)
，使(shǐ)生物化學(xué)從靜態(tài)進入動態，從細(xì)
胞水平(píng)進入分子水平，闡明(míng)了一係列重大問(wèn)
題
，如遺傳(chuán)
密碼(mǎ)🦳，細胞膜受體，RNA-DNA逆(nì)轉錄等🤜，使人類對生命(mìng)基本現象(xiàng)的認識開辟了一條新的途徑。下麵僅(jǐn)就同位素示蹤技術在生物(wù)化學(xué)和分子生物學(xué)中應用的幾個主要(yào)
方麵(miàn)作一介紹。
1.物質(zhì)代放謝的研究
　　體(tǐ)內存在著很多種(zhǒng)物質，究竟它們之(zhī)間是如(rú)何(hé)轉變的(dí)，如果(guǒ)在研(yán)究中應用適當的同位素標記物作示蹤劑分(fēn)析這些物質(zhì)中同位素含(hán)量的變化(huà)
🥮，就可以知道它們之間相(xiāng)互轉變的關係(xì)，還能分(fēn)辯(biàn)出誰是前身物，誰是產物 ，分析同位素示蹤劑存在於物質分子的哪些原子上(shàng)，可以進(jìn)一步推(tuī)斷各種物質之(zhī)間的(dí)轉變機製
。為了研究(jiū)膽(dǎn)固醇的生(shēng)物合(hé)成及其代謝
，采用標記前身物的方法，揭示了膽固醇的生成途徑和步驟，實(shí)驗證明，凡是能在(zài)體(tǐ)內轉變為乙酰輔酶A的(dí)化合物，都可以作為生成膽固(gù)醇(chún)
的原料，從乙酸(suān)到膽固醇的全部生(shēng)物合成過程(chéng)🌮，至少包括36步化學反(fǎn)應，在鯊烯與(yǔ)膽固(gù)醇之間，就(jiù)有二(èr)十個中間物，膽固醇的生物合成途徑可(kě)簡化為(wéi):乙(yǐ)酸→甲基二羥戊酸→膽(dǎn)固醇(chún) 又如在研究肝髒膽(dǎn)固醇的(dí)來(lái)源時，用放射性同位素標記物3H－膽固醇作靜脈注射的示蹤實驗說(shuō)明
，放射(shè)性大部分進入肝(gān)髒，再出現在糞(fèn)中🀇，且甲狀腺素能加速這個過程，從而可說明肝(gān)髒是處理血漿(jiāng)膽固醇(chún)的(dí)主要器官，甲狀腺能(néng)
降低血中膽固醇含量的機理(lǐ)🦥，在於它對血(xiě)
漿膽固醇向肝髒轉移過程的加速作(zuò)用🌫
。
2.物質轉化的研(yán)究
　　物質(zhì)在機體內相(xiāng)互轉化的(dí)規(guī)律(lǜ)是生命(mìng)活動中重要的本質(zhì)內容(róng)，在過去的物質轉化(huà)研(yán)究中，一(yī)般都采用用離體酶學方法
，但是離體酶學(xué)方法的研究(jiū)
結果，不一定(dìng)能代表整體情況，同位素示蹤(zōng)技術的應用(yòng)
，使有關物質轉化的實驗的周(zhōu)期大大縮短，而且(qiě)
在離(lí)體，整體，無細胞體(tǐ)係的情況(kuàng)下都可應用，操作簡化，測(cè)定(dìng)
靈敏度提高，不僅能(néng)定性，還可作定(dìng)
量分析。 在闡(chǎn)
明核糖苷酸向脫(tuō)氧核糖核苷(gān)酸轉化(huà)的研(yán)究中，采用雙標記法，對產物作雙標記測(cè)量(liáng)或經化學分離後分別測量(liáng)其放射性。如(rú)在鳥(niǎo)嘌呤核苷酸（GMP）的鹼基(jī)和核糖(táng)上分別都標記上14C🗃，在離體係統中(zhōng)使(shǐ)之參入脫氧鳥嘌呤核苷(gān)酸（dGMP），然後將原標記物和產(chǎn)物（被雙標記GMP摻(chān)入的(dí)dGMP）分別(bié)進行酸(suān)水(shuǐ)
解和(hé)層(céng)
析分離(lí)後，測(cè)定它們各自的鹼基和(hé)戊糖的放(fàng)射性，結果發現(xiàn)它們的兩部分的放(fàng)射性比(bǐ)值(zhí)基本相等
🌠，從而證明了產物dGMP的戊糖就原標(biāo)記物GMP的戊糖，而(ér)沒有別的來(lái)源，否則產物dGMP的鹼基和核糖的(dí)比值一定與(yǔ)
原標記物GMP的兩部分比值有顯著差別。這個實(shí)驗說(shuō)明(míng)戊糖脫氧是在鹼基與(yǔ)戊糖不分記(jì)的情況下進(jìn)行的(dí)
，從而證明了脫氧(yǎng)核糖(táng)核苷酸是由(yóu)核(hé)糖核苷酸直(zhí)接轉(zhuǎn)化而來的(dí)，並(bìng)不是核糖核苷(gān)酸先(xiān)分解成核糖與鹼基，鹼基(jī)再重新接上(shàng)
脫氧杭核糖。無細胞的示(shì)蹤實(shí)驗可以分析物質(zhì)在細胞(bāo)內的轉化條件
，例(lì)如以3H-dTTP為前(qián)身物作DNA摻入的示蹤(zōng)
實驗
，按(àn)一定的實驗(yàn)
設計摻入後，測定產物(wù)DNA的(dí)放射性，作(zuò)為新合成(chéng)的DNA的檢出指標。
3.動(dòng)態平衡的研究
　　闡明生物體內物質處於不斷更新的(dí)動態平衡之中，是放射性同位素(sù)示蹤法對生命科(kē)學的重大貢獻之一
👸，向體內引入適當的同位素(sù)
標記物🤊，在不同時間(jiān)測定物質中同位素含量的變化(huà)，就能了解(jiě)該物質在體內的變(biàn)動(dòng)情況，定量計算出體內(nèi)
物質的代謝率，計算出物質的更新速度和更新時(shí)間等等🃿。機體內的各種物(wù)質都在有大(dà)小不同的代謝庫，代謝庫的大小(xiǎo)可用同位素稀釋(shì)法求也。
4.生物樣品中微(wēi)量物(wù)質的分析
　　在放射性同位素示蹤技術被應用(yòng)之前，由於製(zhì)備樣(yàng)
品時的丟(diū)失而造成回收率低以及測(cè)量靈敏度不高(gāo)等問題
，使得(dé)對機體正常(cháng)功能起很(hěn)重要作用的微量物質不易被測定(dìng)。近年來迅速發展(zhǎn)
，應用愈來愈廣泛的放射(shè)免疫分析(xī)（radioimmunoassay）技(jì)
術是一種超微量的分析方法💢，它可測定的物質300多種(zhǒng)，其中激素類居多，包括類固醇激素，多肽類激素，非肽類激素🕾
，蛋白質物質，環核苷酸，酶，腫瘤相關的抗(kàng)原，抗體以及病(bìng)原體，微量藥物等(děng)其它物質。
5.最近鄰序列分析法（Nearest neighbour-sequence analysis method）
　　放射性同位素示蹤(zōng)技術🂷，是分(fēn)
子生物學研究中的(dí)重要(yào)手(shǒu)段之(zhī)一，對蛋白質生物合成(chéng)的研究(jiū)
，從DNA復製(zhì)，RNA轉錄到(dào)
蛋白質翻譯均起了很大的作用。最近(jìn)鄰序列分析法應用同位(wèi)素(sù)
示蹤技術結合酶切理論和統(tǒng)計學理論，研究證實了DNA分(fēn)
子中鹼基排列規(guī)
律，在體外作合成(chéng)DNA的實驗：分四批進行，每批用一(yī)
種不同的32P標記脫(tuō)氧(yǎng)核苷三磷(lín)酸🥽，32P標記在戊糖(táng)5''C的(dí)位(wèi)置上，在完全條件下合成後🕇，用特定的酶打開5''C－P鍵(jiàn)，使原鹼基上通過戊糖5''C相連的32P移到最鄰近的另一單(dān)核苷酸的3''C上 🌺。用(yòng)最近鄰序列分析法(fǎ)首次提出了DNA復製與(yǔ)RNA轉錄的(dí)分(fēn)子生物學(xué)基礎，從而建立了分子雜(zá)
交技(jì)術
，例如以(yǐ)噬體T2-DNA為模板製成[32P]RNA，取一定量(liáng)T2-DNA和其它一(yī)些DNA加入此[32P]RNA中，經加熱使DNA雙鏈打開，並溫育，用(yòng)密度梯(tī)
度離心(xīn)或(huò)微孔膜分離出(chū)DNA-[32P]RNA復合體測其放射性
，實驗(yàn)結(jié)果隻有菌體T2的DNA能與(yǔ)該[32P]RNA
形成放射性復合體(tǐ)。從而證明了RNA與DNA模板(bǎn)的鹼基呈特殊配(pèi)對的互(hù)補關係，用分子雜交技術還證實了從(cóng)RNA到DNA的(dí)
逆轉錄現象。此外，放射性(xìng)同位素示蹤(zōng)技術對分子生(shēng)物學(xué)的貢獻還表現在🌡：⑴對蛋(dàn)白質(zhì)合成過程中三個連(lián)續階段(duàn)，即肽鏈(liàn)的起(qǐ)始，延伸和終止的研究(jiū)；⑵核酸的分離和(hé)純化(huà)🚜；⑶核(hé)酸末(mò)端核苷酸(suān)分析，序列測定；⑷核酸結構與功能的關係；⑸RNA中的遺傳信息如何通過核(hé)苷(gān)酸(suān)的排列(liè)順序向蛋質中氨基酸傳遞的研(yán)究等等。為了更好(hǎo)地應用放射性同位(wèi)素示蹤技術🐪，除了有(yǒu)賴於示蹤劑的高(gāo)質量和核探測器的高(gāo)
靈敏度外，關(guān)鍵還在於有科(kē)學根據的設想和創造(zào)性的實驗設計以及各種新技術的(dí)
綜(zōng)合應用🎄。